그레뉼로사이트 모자이크2 Granulocytes Mosaic2 - 의약품 상세정보

이 검사 키트는 사람의 혈청이나 혈장에서 사람항체의 정량측정을 위하여 고안되었다.

바이오칩 슬라이드(BIOCHIP Slide)의 반응영역을 덥고 있는 도말(smear)된 기질의 조합(combination of substrate)인 에탄올로 고정된 과립구(granulocytes)와 포름알데히드로 고정된 과립구에 희석된 검체와 함께 배양된다. 만약 검체가 양성이면, IgA, IgG 그리고 IgM의 특이적 항체가 과립구의 항원에 부착된다. 두 번째 단계에서, 부착된 항체는 형광표지된 항-사람 항체로 염색되어 형광 현미경으로 판독할 수 있게 된다.

1)검체의 준비 및 안정성

(1) 안정성 : 혈청(Serum) 검체는 일반적으로 +2℃~+8℃에서 14일 안에 저장된 것이 검사되어진다. 냉장고에 장애가 없다는 조건으로 28일 동안 검체의 저장이 가능하다. 이 경우, 검체는 육안과 냄새(후각 이 지적하는 박테리아의 오염 발생)로 확인되어야 한다. 희석된 검체는 하루 일과 동안에만 배양(incubate)된다.

(2) 검체 희석

classes IgG의 항체 결정 : 혈청 검체를 검사하려면 PBS-Tween으로 다음과 같이 희석하고 충분하게 혼합 시킨다. (즉, 4초 동안 볼텍스)

*매 단계의 희석 후에는 carryover를 방지하기 위하여 새로운 파이펫 팁을 사용한다.

2) 시약의 준비와 안정성

주의 : 한 Lot의 각각의 시약은 다른 Lot의 시약과의 혼합 사용을 금한다.

(1) 슬라이드(Slides) : 바로 사용 가능. 오직 실온에 도달하였을 때에만(그렇지 않으면 응축된 물이 기질에 손상을 준다) 보호 커버를 제거한다. felt-tip 팬으로 표시한다. BIOCHIPs은 만지지 않는다. 보호 커버를 제거한 후 이 슬라이드는 15분 정도 보온(incubate)한다. 만약 보호 커버가 손상을 입었다면 이 슬라이드는 진단에 절대 사용하지 않아야 한다.

(2) Fluorescein-labelled secondary antibody(FITC) : 1:5의 비율로 PBS-Tween과 희석한다. 처음 FITC를 사용하기 전에 파이펫으로 완전하게 혼합한다. Aliquot으로 요구되는 양만을 이동시키고 이것은 희석한 같은 날에 사용한다.

(3) 양성 및 음성대조 혈청 : 바로 사용 가능(희석하지 않는다). 처음 대조혈청을 사용하기 전에 파이펫으로 충분하게 혼합한다.

(4) PBS-Tween : “Salt for phosphate buffer” 한 팩을 1 리터의 증류수(최적조건 : aqua pro infusione)에 용해 시키고 거기에 Tween 20 2ml을 혼합한다. 준비된 PBS-Tween은 일반적으로 +2℃~+8℃에 1주일간 저장한다. PBS-Tween이 만약 혼탁하거나 오염이 나타나면 사용하지 않는다.

(5) Embedding medium(포매,包埋, 매질) : 바로 사용 가능.

3) 시험방법

TITERPLANE 기술은 면역적 분석시험을 표준화하기 위해 EUROIMMUN에 의해 개발되었다 : 검체나 표지항체(labelled antibodies)는 reagents’ support의 반응 필드의 표면에 붙인다. BIOCHIP 슬라이드는 reagents’ support(슬라이드의 모든 BIOCHIP에 유체에 접촉된다.)의 함요(陷凹, recess)로 옮긴 다음 개별적인 반응이 동시에 시작된다. 소적(小滴, droplets)의 위치와 높이는 시스템의 기하학에 의해 정확하게 결정된다. 액체는 폐쇄 공간에 제한함으로써 전통적인 “humidity chamber”가 필요 없게 되었다. 이것은 많은 수의 검체와 다음의 다른 샘플을 동시에 동일 조건에서 incubate하는 것을 가능하게 하였다.

(1) Prepare(준비) : 시약과 검체에 대한 준비는 앞 페이지에 이미 기술하였다.

이때 reagent’s support도 필요하다.

(2) Dilute(희석) : 혈청 샘플을 앞 페이지의 “검체 희석”에 따라 준비한다. 컨트롤은 사용하기 전에 충분하게 혼합한다. 컨트롤은 희석하지 않고 바로 사용한다.

(3) Pipette(분주) : 희석 검체 25ul를 reagents’ support의 각 반응 필드에 분주한다. 양성과 음성 컨트롤도 25ul를 각 반응필드에 분주한다. 이때 공기 방울은 피한다. Incubation을 시작하기 전에 (200 droplet 까지) 검사할 모든 검체를 옮긴다. polystyrene pipetting template를 사용한다.

(4) Incubate(배양) : BIOCHIP 슬라이드의 reagents’ support의 함요(陷凹, recess)에 적응(fitting)에 의해서 반응이 시작된다. 각 검체는 BIOCHIP과 접촉을 확실하게 하여 개별적인 검체가 다른 검체와는 접촉되지 않게 한다. 실온에서 30분간 incubation 한다.

(5) Wash(세척) : BIOCHIP 슬라이드는 비이커를 사용해서 PBS-Tween을 흘려 씻어 내리고 이것을 그 후 즉시 최소 5분간 PBS-Tween이 담겨있는 큐벳에 담근다. 만약 가능하다면 rotary shaker를 이용하여 shaking (max. 300 rpm)한다.

(6) Pipette(분주) : 세척된 reagents’ support의 각 반응 필드에 20 ul fluorescein-labelled anti-human globulin (conjugate)을 떨어뜨린다. 연속된 incubation 전에 모든 droplets (최대 50 슬라이드의 시약)을 하여야 한다. Stepper pipette을 사용한다. PBS-Tween 희석한다.

(7) Incubation(배양) : PBS-Tween으로부터 하나의 BIOCHIP 슬라이드를 제거한다. 5초 이내에 오직 여백과 장축(long sides) 부분의 얼룩을 제거하고 즉시 reagents’ support의 함요(陷凹, recess)에 놓는다. 반응 필드 사이의 부분은 건조 시키지 않는다. BIOCHIP과 liquids 사이가 잘 접촉되었는지 확인한다. 그리고 나서 다음 BIOCHIP 슬라이드를 진행한다. 이제부터는 직사광선으로부터 슬라이드를 보호한다. 실온에서 30분간 incubation 한다.

(8) Wash(세척) : BIOCHIP 슬라이드는 비이커를 사용해서 PBS-Tween을 흘려 씻어 내리고 이것을 그 후 즉시 최소 5분간 PBS-Tween이 담겨있는 큐벳에 담근다. 만약 가능하다면 rotary shaker를 이용하여 shaking한다. 대비염색(counterstaining)을 위하여 Evans Blue 10 drop을 각 150 ml phosphate buffer에 첨가한다.

(9) Embed : 커버유리 위에 glycerol/PBS를 반응 필드 당 10 ul씩 분주한다. polystyrene embedding template를 사용한다. PBS-Tween으로부터 BIOCHIP 슬라이드를 제거한 후 후면, 모든 사면, 주위 표면, 을 말린다. 그러나 종이 타월로 반응 필드 사이는 말리지 않는다. BIOCHIP 슬라이드를 준비된 커버유리 위에 뒤로 뒤집어 놓는다. 커버유리가 슬라이드의 홈에 적합하게 끼워져 있는지 즉시 확인한다. 가능하다면 정확한 위치에 올 수 있게 한다. 다음번의 BIOCHIP 슬라이드도 동일한 방법으로 실행한다.

(10) Evaluate (평가) : 형광 전자 현미경(fluorescence microscopy )으로 판독한다.

4) 결과의 해석

(1) Fluorescence pattern (positive reaction) : 에탄올로 고정된 과립구의 세포질에 대한 자가항체의 경우에는 두 가지의 관련된 형광 패턴으로 구별된다. :

과립상의 형광 (granular fluorescence)은 과립구의 세포질 전체에 걸쳐서 규칙적으로 분포되어있다. 나머지 셀 핵이 없는 것(cANCA, cytoplasmic type)은 호중구의 아주르친화성 과립상이 위치한 단백분해효소 3 (proteinase 3)에 대한 항체가 원인이다. 과립구의 일부(호산성·, 호염기성·)는 반응하지 않는다.

Smooth fluorescence은 과립구의 셀 핵 주위를 리본 모양으로 둘러싼(pANCA, perinuclear type)것은 다양한 특이성의 항체에 의해서이다.

지금까지 확인된 표적 항원은 myeloperoxidase(MPO), granulocyte-specific elastase, lactoferrin, lysozyme, beta-glucuronidase 그리고 cathepsin G가 있다.

만약 검체(컨트롤)가 음성이면 과립구는 검게 나온다.

과립구(호산성, 호염기성)의 일부에서의 과립상 세포질의 형광은 일반적으로 명백하지 않다. 과립구를 포함한 핵 항원에 대한 일부의 항체 역시 반응을 나타낸다. 그러나, 이것은 미토콘드리아에 대한 항체에는 적용되지 않는다.

부가적인 항원 substrate 로써 영장류 간과 헵-2 셀을 이용함으로써 간세포의 핵에 가까이, 접하여 놓여있는 간의 동양혈관(洞樣血管, sinusoids)안의 과립구에 의하여 pANCA 와 ANA 를 확실하게 구별할 수 있으며, 이 두 개를 광학으로 관찰이 가능하다. 헵-2 셀은 오직 과립구에 특이적이지 않는 자가항체와 만 반응한다

(2) Evaluation (평가) :

* 여기서 “titer”란 항체의 농도를 뜻한다.

5) 임상적 의미

(1) cANCA : 베그너 육아종증(肉芽腫症)(Wegener’s granulomatosis – a febrile, chronic granulomatous disease of the nasopharynx, lungs and kidneys.)

(2) pANCA: 베그너 육아종증(肉芽腫症)(Wegener’s granulomatosis), 미시적 동맥염(microscopic arteritis), Churg-Strauss syndrome, Goodpasture syndrome

6) 검사의 한계

양성 ANCA의 결과를 구별하기 위해서는 ANCA Profile ELISA를 추가 검사해야 한다.