백칩에이취1440킷트 - 의약품 상세정보

다음의 시약 및 기구는 킷트에서 제공되지 않으므로 검사지는 검사전에 준비하여야한다.

1) 필요시약

2) 필요기구

3) 성상확인

킷트를 개봉하여 구성물들이 별첨2. 성상항에 기술되 성상과 일치하는지를 확인한다.

4) 해동

냉동(-20도) 보관 구성물 중 보관온도에서 고상인 구서물들은 상온에 정치하여 녹인다.

시험자는 마크로결백치 에에취 1440 킷트로 분석 의뢰된 검체의 양이 충분하지 화깅ㄴ하고 기준치에 미달한 경우 시험에 필요한 양만큼 다시 채취하도록 분석 의뢰자에게 요구하여야 한다. DNA 추출까지 아래의 조건에서 보관한다.

1) 검체의 전처리관정

- 양수액 검체의 전처리 과정

1. 15ml 플라스틱 튜브를 준비한 후 양수액 4ml을 넣고 원싱분리한다.(1500rpm5분 상온)

2. 상충액 3.5mlfmf 피펫으로 제거한후 10초간 vortex한다.

3. 1.5ml 원심분리튜부룰 준비한후 15ml 플라스틱 튜브에 남아있는 요액 0.5mldmf 옮기고 원심부라한다.(13000rpm 1분 상온)

4. 피펫을 이용하여 바닥에 있는 pellet만 남기고 상충액을 제거한다.

5. Cell Lysis Solution 600uL를 첨가하고 5초간 vortex 한다.

6. 55도로 맞추어진 Hest Block에서 15분간 정치한다.

7. 상온에서 5분간 정치시킨후 검체 DNA 추출과정으로 진행한다.

-융모막 검체의 전처리 과정

1. 2개의 Pertridishdptj PBS 5mL씩을 분주한다.

2. 융모막조직을 PBS가 담긴 2개의 Petridish에 차례로 흔들어서 혈액을 제거한다.

3. 융모막 조직을 새로운 Petri dish 에 놓고 해부현미경으로 관찰하면서 수술용 칼을 이용하여 융모막 조직에서 모체조직(Decide)를 제거한다.

4. 모체조직이 제거된 융모막 조직을 새로운 Petri 야노에 놓고 수술용 칼로 잘게 다져준다.

5. 1.5mL 원심분리튜브에 좁쌀 크기의 융모막 조직 Cell Lysis Solution 600uL Proteinases K &uL를 차례로 넣어준다.

6. 55도 로 맞춰진 Heat block에서 2시간 정치한다. 매 30분바다 5초간 Vortex 한다.

7. 상온에서 5분간 정치시킨후 검체 DNA 추출과정으로 진행한다.

-제대혈 및 말초혈액 검체의 전처리 과정

1. 1.5mL 원심분리튜브를 준비한후 RBC Lysis soluton 900ul 와 제대혈 혹은 말초혈액 300uL 넣고 10초간 vortex 한다.

2. 상온에서 5분간 정치한 다음 원심분리한다. (13,000rpm 1분)

3. 피펫을 이용하여 1.5ml 원심분리튜브 바닥에 있는 pellet만 남기고 상충액을 제거한다.

4. Cell Lysis Soluton 600uL 첨가하고 5초간 정치한다,6. 상온에서 5분간 정치시킨후 검체 DNA 추출과정으로 진행한다.

-태반 융모 검체의 전처리 과정

1. 2개의 플라스틱 접시에 PBS 5mL씩을 분주한다.

2. 태반 융모 조직을 PBS가 담긴 2개의 Petri dish 에 차례로 흔들어서 핼액을 제거한다.

3. 태반 융모 조직을 새로운 Petri dish에 놓고 수술용 칼로 잘게 다져준다.

4. 1.5mL 원심분리튜브에 좁쌀 크기의 태반 융모 조직 Cell Lysis Solution 600uL, Proteinase K &uL를 차례로 넣어준다.

5. 55도로 맞춰진 열관에서 2시간 정치한다, 매 30분마다 5초간 vortex한다,

6. 상온에서 5분간 정치시킨후 검체 DNA 추출과정으로 진행한다.,

-배양 세포의 전처리 관정

1. 1.5mL 원심분리튜브에 Cell Lysis Solution 600uL 배양 세포 15uL(3*10⁶Cells), Proteinase K &uL를 차례로 넣어준다

2. 55도로 맞춰진 열관에서 2시간 정치한다., 매 30분마다 5초간 vortex 한다

3. 상온에서 5분간 정치시킨후 검체 DNA 추출과정으로 진행한다.

2) 검체 DNA 추출과정

1. 전처리 된 검체에 RN ase A 2uL를 첨가하고 3초간 Vortex 한다.

2. 37도 인큐베이터에서 15분간 반응한다.

3. Protein Precipitation 150uL를 첨가한다.

4. 10초간 vortex 한후 얼음조각이 든 상자에 5분간 정치한다.

5. 원심분리(13,000rpm 4분 ,상온) 후 상층액 700uL을 새롱누 13mL 원심분리튜브에 옮긴다.

6. Isopropanol 600uL과 Glycogen soluton 1uL를 첨가한후 3초간 vortex 한다.

7. 원심분리 (13.000rpm 10분 상온)후 상충액을 부어서 버리고 70% 에탄올 150uL를 첨가한다.

8. 원심분리 (13.000rpm 5분 상온) 후 피펫을 이용하여 1.5mL 원심분리튜브 바닥에 남아있는 pellet만 남기고 상충액을 모두 버린다.

9. 1.5mL 원심분리 튜브의 뚜껑을 열어놓고 상온에서 10분간 정치한다.

10. DNA Hydration Solution 100 uL를 첨가한다(단, 검체가 양수액에서 추출한 DNA 일 경우 DNA Hydration Solution 25uL를 첨가한다.)

11. 55도로 맞춰진 Heat block에 30분간 정치시킨다.

12. 3초간 vortex 한후 20도에 보관한다.

4) 추출된 DNA의 확인

(1) Agarose gel 전기영동 (Electrophoresis)

1. 1* TAB Buffer에 Agarose 분말을 녹여 1% Agarose gel을 만든다.

A. 혈액(제대혈, 말초혈액) 조직(융모막, 태반음모) 또는 배양세포에서 추출한 DNA 액인 경우 1.5mL 원심분리 튜브에 추출한 DNA 액 10uL 와 정제수 90uL를 넣고 3초간 vortex 한후 spin down 한다.( 검체 DNA 희석액) 새로운 1.5 mL 원심분리튜브에 검체 DNA 희석액 4uL 와 2* DNA Loading Dye 4uL를 넣는다.\

B. 양수액에서 추출한 DNA 액인 경우 : 1.5mL 원심분리튜브에 추출한 DNA 액 4uL 와 2* DNA Loading Dye 4uL 를넣는다.

2.1% Agarose gel을 1* TAE Buffer 로 채워진 전기영동기에 넣는다.

3. 50nGuL 2Hind3 Marger 4uL 와 2*DNA Loading Dye 가 혼합된 DNAdor 8uL을 차례로 Loading 한다.

4. 2*DNA Loading Dye가 30mm 정도 sofudhfEoRK지 전개시킨다.

5. 1% Agrose gel을 꺼내 Gel image analyzer에서 결과를 출력 및 저장한다.

(2) Agarose gel 전기 염동을 통한 DNA액의 농도 확인

추출된 DNA 액의 농도는 DNA 액과 2Hind3 Marker와의 밴드강도를 비교함으로써 확인한다. 예를 들면 양수에서 추출한 검체 DNA 액의 밴드강도가 2Hind3 Marker의 밑에서 3번째 밴드강도와 동일하면 검체 DNA 액의 농도는 2.5mg/uL 이 된다. 밴드번호 4는 2*DNA Loading Dye 가 지나가는 부분이므로 실제 농도보다 밴드강도가 낮게 나오므로 비교할수 없다. 혈액 조직 및 배양세포에서 추출한 검체 DNA 액의 농도는 검체 DNA 희석액으로 계산된 농도의 10배이다. 양수액에서 추출한 검체 DNA 액과 혈액, 조직 및 배양세포에서 추출한 검체 DNA 희석액의 농도는 2.5mg/u 이상이 되어야 한다.

1) 표지화 반응과정

1, 1.5mL 원심분릴 튜브 2개를 준비한다.

A. 제대혈,말초혈액 및 융모막에서 추출한 검체 DNA 액일 경우 아래표에서 제시된 양만큼 검체 DNA dor 및 Refereace DNA 를 각가 넣고 Sterile Water 로 전체 비ㅜ피가 각가 21uL가 되도록 한다.

2. 두 튜브에 2.5* Random Primers Slution 20uL 을 각각 넣는다.

3. 3초간 vortex 한후 spin down 한다.

4. 두 튜브를 100도 Heat block에서 5분간 끓인후 즉시 얼음욕조로 옮겨 5분간 정치한다.

5. 두 튜브를 spin down 한후 10* dNTP Nucleotide Mix 5uLTlr 각각 넣는다.

6. 검체 DNA dor 튜브에는 Cy3-dCTP 3uL 를 Reference DNA 튜브에는Cy3-dCTP 3uL 를 넣어준다.

7. -20도에 보관되어있는 Exo- Klinow Fragment(13번) 튜브를 꺼내어 spin down 한 후 얼음욕조에 보관한다.

8. 두 튜브에 Exo- Klenow Fragment 1uL를 각각 넣어준다.

9. 두 튜브를 3초간 vortex 한후 spin down 하여 37도 Incubator에서 16시간 동안 반응시킨다.

2) 표지화 반응액 정제 과정

1. 검체 DNA 액 및 Reference DNA 이 들어있는 1.5mL 원심분리튜브 각각에 TE Buffer 50uL 와 Purification Solution A 400uL를 넣어주고 3초간 vortex 한후 spin down 한다.

2. 두 1.5ml Collection Tubes 를 각각 Purification Columns 하단에 끼운다.

3. 1.5mL 원심분리튜브에 담겨져 있는 요액 500uL 을 피펫으로 회수하여 1.5mL Collection Tubes 와 결합된 Purification Columns 에 각각 로딩(loading)하고 원심분리한다. )13,000rpm 1분 상온)

4. 1.5ml Collection Tubes 를 Purificaton Columns에서 분리한후 1.5mL collection Tubes 안에 모인 용액을 버린다.

5. 1.5mL Collection Tubes 를 Purificaton Columns에 다시 끼우고 Purificaton Columns에 Purification Solution B 600uL 를 넣어준 다음 원심분리 한다.(13,000 rpm 1분 상온)

6. 1.5mL Collection Tubes 를 Purificaton Columns에서 분리한후 1.5mL Collection Tubes 안에 모인 용액을 버린다.

7. 1.5mL Collection tubes 를 Purificaton Columns 에 다시 끼우고 Purificaton Columns 에 Purificaton Solution B 200uL 를 넣어준 다음 원심분리한다,(13,000 rpm 1분 상온)

8. 1.5mL Collection Tubes 를 버리고 Purificaton Columns 밑에 새로운 1..5ml 원심분리튜브를 끼운다.

9. Purificaton Columns 안에 정제수 50uL 을 떨어뜨리고 빛이 차단된 장소에서 3분간 사온에 방치한후 원심분리한다. (13,000 1분 상온)

10. 같은 Purificaton Columns 안에 다시 한번 더 정제수 30uL 를 떨어뜨리고 빛이 차단된 장소에서 3분간 상온에 방치한후 원심분리한다, (13,000rpm 1분 상온)

11. Purificaton Columns를 버리고 각각 표지화된 DNA dor 80uL 이 담겨있는 튜브의 뚜껑을 닫은 다음 빛이 차단되는 곳엣 상온 보관한다.

1) 표지화 반응액의 에탄올 침전 과정

① 새로운 1.5ml 원심분리튜브에 표지화된 검체 DNA 액(Cy3-dCTP) 80㎕, 표지화된 Reference DNA

(Cy5-dCTP) 80㎕, Human Cot-1 DNA 70㎕, Sodium Acetate 20㎕ 그리고 100% 에탄올 600㎕ 를

혼합한다.

② 3초간 vortex 한 후 -20℃에서 60분간 방치한다.

③ 원심분리 한다 (13,000rpm, 20분, 4℃).

④ 상층액을 버린 후 70% 에탄올 500㎕을 넣는다.

⑤ 원심분리 (13,000rpm, 10분, 4℃) 한 후 상층액을 버린다.

⑥ Spin down 한 후 튜브 바닥에 있는 보라색 pellet 만 남기고 피펫으로 남은 에탄올을 제거한다.

⑦ 튜브의 뚜껑을 연 상태에서 빛이 차단되는 곳에서 10분간 방치한다.

⑧ 보라색 pellet이 있는 튜브에 Hybridization Solution 40㎕과 Yeast tRAN 4㎕를 넣고(하이브리드화

반응액) 뚜껑을 닫은 다음 빛이 차단되는 곳에서 30분간 방치한다.

⑨ 튜브 바닥에 있는 보라색 pellet이 완전히 풀어질 때까지 텝핑(tapping) 한 후 spin down 한다.

⑩ 빛이 차단되는 곳에서 상온 보관한다.

2) Macroger BAC Chip H1440의 전처리 과정

① 새로운 1.5ml 원심분리튜브를 준비한 후 전처리 반응액으로 사용되는 Hybridization Solution 30㎕ 와

Salmon Sperm DNA 10㎕를 넣고 70℃로 맞춰진 Heat block에서 10분간 정치 시킨다.

② 얼음욕조로 옮겨 5분간 정치한 후 spin down 한다

③ Spin down 한 전처리 반응액을 모두 취하여 Macrogen BAC Chip H1440 중앙에 떨어뜨리고

Coverglass 를 덮는다. 이때 기포가 생기지 않도록 한쪽 면부터 천천히 Coverglass를 덮는다.

④ Macrogen BAC Chip H1440을 슬라이드 박스에 넣고 상온에서 30분간 정치시킨다.

⑤ 핀셋을 이용하여 Macrogen BAC Chip H1440의 Spotting area를 손상시키지 않도록 핀셋을 이용하여

Coverglass 를 주의하여 벗겨낸다.

⑥ Macrogen BAC Chip H1440을 슬라이드랙에 끼우고 정제수가 든 세척용기에 담근다.

⑦ 슬라이드랙을 위아래로 10회 흔들어 준 다음 정제수가 든 새로운 세척용기에 담근다.

⑧ 슬라이드랙을 다시 상하로 10회 흔들어 준 다음 Isopropanol 이 든 세척용기에 담근다

⑨ 슬라이드랙을 다시 상하로 10회 흔들어준 다음 바닥에 종이타올을 까라고 Macropen BAC Chip H1440 의 바코드가 아래로 향하도록 하여 털어서 여분의 Isopropanol 을 최대한 제거해 준다.

⑩ 50ml 플라스틱 튜브 하나에 Macrogen BAC Chip H1440 하나씩 넣고 원심분리한다(1,500rpm,5분,상온)

⑪ 원심분리 후 50ml 플라스틱 튜브에 들어 있는 슬라이드를 꺼내 슬라이드 박스에 상온 보관한다.

3) Macrogen BAC Chip H1440의 하아브리드화 과정

① 하이브리드화 반응액 44㎕가 든 튜브를 70℃로 맞춰진 Heat block에서 15분간 정치 시킨 후 37℃Incubator에서 한 시간 동안 정치한다.

② 전처리가 끝나 슬라이드 박스에 보관되어 있는 Macrogen BAC Chip H1440을 꺼낸다.

③ 37℃ Incubator에 정치되어 있는 하이브리드화 반응액을 꺼내서 spin down한다.

④ 하이브리드화 반응액을 모두 취하여 그림에서 보는 바와 같이 Macrogen BAC Chip H1440의 Spotting area 중앙 위아래에 보라색의 하이브리드화 반응액 두 방울을 떨어뜨리고 공기방울이 생기지 않도록 조심스럽게 Coverglass를 덮는다.

⑤ 슬라이드 박스에 넣어 37℃ Incubator 내에서 42-48시간 동안 반응시킨다.

Incubator 내에 있는 쟁반에 저어제수가 충분히 있는지 확인한다.

① 세척용액 1일 둘어있는 세척용기에 비어있는 슬라이드랙을 넣는다.

② 하이브리드화 반응이 끝난 Macrogen BAC Chip H1440의 Spotting-area를 손상시키지 않도록 핀셋을 이용하여 Coverglass 를 주의하여 벗겨낸다.

③ Coverglass 를 핀셋으로 제거한 후 바코드가 위로 향하도록 하여 즉시 Macrogen BAC Chip H1440을 슬라이드랙을 끼운다.

④ 슬라이드랙을 위아래로 40번 흔들어 준 다음 46℃에서 15분간 정치시킨다.

⑤ 슬라이드랙을 세척용액 2에 넣은 후 위아래로 40번 흔들어 준 다음 46℃에서 30분간 정치시킨다.

⑥ 슬라이드랙을 세척용액 3에 넣은 후 위아래로 40번 흔들어 준 다음 상온에서 15분간 정치시킨다.

⑦ 슬라이드랙을 세척용액 4에 넣은 후 위아래로 40번 흔들어 준 다음 상온에서 5분간 정치시킨다.

⑧ 슬라이드랙을 70% 에탄올 넣은 후 위아래로 10번 흔들어 준다.

⑨ 슬라이드랙을 85% 에탄올에 넣은 후 위아래로 10번 흔들어 준다.

⑩ 슬라이드랙을 100% 에탄올에 넣은후 위아래로 10번 흔들어 준다.

⑪ 바닥에 조이타올을 깔고 Macrogen BAC Chip H1440 의 바코드가 아래로 향하도록 하여 덜어서 여분의 에탄올을 최대한 제거한다.

⑫ 50ml 플라스틱 튜브에 Macrogen BAC Chip H1440를 넣고 원심분리한다(1,500rpm, 5분, 상온)

⑬ Macrogen BAC Chip H1440을 꺼내서 바로 스케닝한다.

① 마이크로어레이칩분석장치(GenePix4000B, Axon, 미국, 10㎛ Scan resolution), 의 하드웨어 전원을 켠후 컴퓨터를 켠다.

※ 마이크로어레이칩분석장치의 Laser 사양

② 스테너 운영 소프트웨어(GenePix P개 6.0)fmf 실행한다.

③ 스테너 칩 로드를 열어 반응과정이 끝난 Macrogen BAC Chip H1440을 넣고 로드를 닫는다.

④ ‘Hardware Setting' 아이콘을 클릭하여 Hardware Setting 창을 띄우고 default 값을 지정한다.

⑤ ‘Prescan' 아이콘을 눌러 Macrogen BAC Chip H1440 이미지를 Presccan 한다.

⑥ ‘Viewer Scan Area'를 클릭한 다음 Presccan된 이미지에서 실제로 스캔한 부분을 마우스로 드래그(drag)하여 지정한다.

⑦ ‘Data Sscn' 아이콘을 클릭하여 스캐니이을 실시한다.

⑧ 스캐닝이 완료되면 ‘File' 아이콘을 클릭한 후 ’Save Image'를 클릭한다.

⑨ 이미지를 저장할 폴더와 파일이름을 지정하고 파일형식을 ‘Single-image TIFF Files' 로 선택하며 'Wavelength 635와 Wavelength 532’ 에만 체크를 한다.

⑩ ‘확인’을 눌러서 이미지를 저장한다.

⑪ 스캐너 칩 로드를 손으로 열어 스캐닝이 끝난 Macrogen BAC Chip H1440 을 꺼내어 슬라이드 박스에 보관하고 스캐너 로드를 닫는다.

⑫ 다른 Macrogen BAC Chip H1440 을 스탠할 경우 ⑤~⑪ 과정을 반복한다.

⑬ 세척한 모든 Macrogen BAC Chip H1440 의 스캐닝이 끝나면 프로그램을 종료시키고 다음의 분석 과정으롤 진행한다.

① 마크로젠백칩 분석 소프트웨어 (MAC Viewer Clinic 2.1)를 실행한다.

② Step 1 - Load Image; ' Image selection Icons' 에 있는 ‘Image 1’ 버턴을 클릭하고 ‘Load Image’ 버튼을 클릭한 다음 파일 형식을 ‘TIF'로 맞춘 후 스캐닝한 이미지 파일 (파일명_532)를 불러온다. 다시' Image 2' 버턴을 클릭하고 ‘Load Image’ 버튼을 클릭한 다음 파일 형식을 ‘TIF'로 맞춘 후 스캐닝한 이미지 파일 (파일명_635) 를 불러온다. ' Image selection Icons' 에 있는 ’Composite'버튼을 클릭하고 ‘Auto Level Adjust'버튼을 클릭한다.

③ Step - 2 Grid Control/ Load Gene ID: ' Auto Grid'버튼을 눌러 ‘Auto spot finding' 창이 뜨면 ’OK' 버튼을 클릭한다. ‘Gene ID’ 창이 뜨면 ‘Load' 버턴을 클릭하여 'Default Gene ID’ 파일을 선택한 다음 ‘열기’ 버튼을 클릭한 후 ‘OK' 버튼을 클릭한다.

④ Step 3- Grid Ajust; 'Auto execution' 버튼을 누르고 ‘Log Ratio Chart' 가 뜰 때까지 기다린다.

⑤ ‘TITLE'에 실험 명을 기입하고 ’Save Screen' 버튼을 클릭하여 결과를 저장한다.

다음의 판정 기준에 의하여 해당 염색체의 수적 이상에 의한 유전질환을 진단한다.

1) 진단 질환별 판정기준

● M : 염색체 log2 T/R(Test/Reference)signal ratio 평균값

2) 다음의 경우에는 재검사한다.

① 상염색체(1~22번 염색체)의 log2 T/R signal ratio 의 Standard Deviation(SD)가 0.180 이상일 경우.

② 상염색체의 log2 T/R signal ratio 평균값이 0.150 이상이세 0.220 미만일 경우(상염색체의 Gray Zone).

③ X 염색체의 log2 T/R signal ratio 평균값이 0.100 이상에서 0.220 미만일 경우(X 염색체의 Gray Zone).

3) 재검사 결과 판정이 바뀔 때에는 한번 더 재검사하여 동일한 결과가 2번 나온 것으로 판정한다.

4) 재검사 후에도 결과값이 설정한 Gray Zone) 이내로 나올 경우 다른 표준 진단법을 사용하여 검증한다.