튜모스크린엘라이자키트 - 의약품 상세정보

1) 시험을 시작하기 전에 시약에 들어있는 설명서를 잘 숙지한다.

2) 시약을 사용할 때에 Lot No. 가 다른 시약은 같이 사용하지 않는다.

3) 세척을 충분히 하지 않으면 결과와 시험의 재현성에 영향을 미친다.

4) 시험 중에는 기질액과 반응정지액을 분주할 때 튀지 않게 주의하며, 기질액을 분주한 순서대로 반응정지액을 분주한다.

5) 시험에 사용하는 피펫 팁은 일회 사용 후 폐기한다.

6) 전 시험 과정동안 일회용장갑을 착용하고 시험을 한다.

7) 시험 전후로 시험 테이블을 항상 소독한다.

8) 시험을 시작하기 전에 시약을 실온에 둘 때 직사광선을 피하여 둔다.

1) 흡광도 측정기 : 450nm

2) 피펫 : 20㎕, 100㎕, 300㎕

3) 자동피펫(8~12 channels)

4) 흡수지, 타이머

5) 증류수

1) 키트의 내용물을 확인하고 모든 검사 시약은 검사 전 미리 실온에서 30분간 방치하여 실온화 시킨다.

2) 세척액의 조제

농축 세척액은 증류수나 이온 정제수로 10배 희석하여 준비한다.

실험 예)

필요한 양이 500㎖일 경우 증류수나 이온 정제수 450㎖에 농축 세척액 50㎖을 넣어 총 부피가 500㎖이 되도록 한 후 잘 섞어준다.

3) 시료희석액의 조제

희석액은 증류수나 이온 정제수로 10배 희석하여 준비한다.

실험 예)

필요한 양이 500㎖일 경우 증류수나 이온 정제수 450㎖에 농축세척액 50㎖을 넣어 총 부피가 500㎖이 되도록 한 후 잘 섞어준다.

4) 항 사람면역글로불린G-과산화 효소(Horseradish Peroxidase) 접합체액의 조제

효소활성은 불안정하므로 사용하기 직전에 농축효소 접합체액을 시료희석액으로 1: 100 의 비율로 필요한 양만큼 희석한다.

실험 예)

만약 16웰을 시험할 경우 필요한 희석된 효소양은 1.6㎖ 이므로 약 2㎖정도 제조한다. 이 때 시료희석액 1,980㎕에 농축효소 접합체액 20㎕를 넣어 총 부피가 2㎖이 되도록 한 후 잘 섞어준다.

1) 혈청(Serum)을 검체로 사용하며 혈구나 혈액응고성분 등의 고형물은 원심 분리하여 완전히 제거한다.

2) 과산화효소의 활성을 저해하는 물질(예 : 보존제로 쓰는 질화나트륨, NaN3)을 함유하고 있는 검체는 위음성이 나올 수 있으므로 사용하지 말아야 한다.

3) 검체 수집 후 검체(혈청)를 냉장(2-8℃) 보관한다. 만약 검체 수집 후 3일 이상 경과하게 될 경우에는 반드시 검체를 냉동(-20℃) 보관한다.

4) 검체는 사용하기 전에 시료희석액으로 1:25000의 비율로 필요한 양만큼 희석한다.

1) 보정액, 양성대조검체, 음성대조검체(이상-20℃), 반응정지액(상온)을 제외한 모든 시약은 2~8℃에서 보관하며 유효기간 이내에 사용해야 한다. 반응정지액은 실온에서 키트의 유효기간까지 안정하다.

2) 시료희석액이 혼탁하게 변해 있으면 미생물에 의해 오염된 것이니 사용하지 말아야 한다.

3) 기질용액은 무색투명하며, 진한 파란빛을 띄면 사용하지 말아야 한다.

4) 조제된 시약의 보관조건 및 보존기간은 다음과 같다.

5) 개봉된 시약의 보관조건 및 보존기간은 다음과 같다.

1) 검사를 시작하기 전에 냉동, 냉장보관 검체와 키트는 실온에서 30분간 방치하여 실온화 시킨다. 플레이트는 상온이 된 후에 개봉하여 사용해야 한다.

2) 검사에 필요한 웰의 수를 정한다. 각 검사 시, 시험하고자 하는 검체의 수에 추가로 8개의 웰 (2개의 Blank, 2개의 보정액, 2개의 양성대조검체, 2개의 음성대조검체)이 더 필요하다. 남은 웰은 지퍼 백에 실리카겔과 함께 밀봉하여 4℃에서 냉장 보관한다. 지퍼 백 내에 습기가 들어가면 항원의 역가가 저하될 수 있으니 주의한다.

3) 보정액, 음성대조검체, 양성대조검체, 25,000:1로 희석한 혈청 검체를 각 웰 당 100㎕씩 분주한다. Blank로 사용할 웰에는 시료희석액을 100㎕씩 분주한다.

* 대조검체 및 검체의 반응시간의 편차를 최소화하기 위하여 검사 시 대조검체 및 검체를 10분 이내에 넣는다.

4) 분주가 끝난 플레이트는 비닐 접착 커버필름을 웰 스트립(strip)의 크기에 맞게 잘라 위를 덮어준 후 실온에서 2시간 동안 반응시킨다. (20~27℃)

5) 농축효소접합체액을 시료희석액으로 1: 100의 비율로 필요한 양만큼 희석한다.

6) 각 웰의 내용물을 흡입하여 제거하고 희석한 세척액으로 웰 당 200㎕씩 3회 세척한다.

7) 플레이트를 뒤집어 흡습지 위에 털어 남아 있는 세척액을 완전히 제거한 다음 자동 피펫으로 희석된 효소접합체액을 각 웰에 100㎕씩 분주한다.

8) 분주가 끝난 플레이트는 비닐 접착 커버필름을 웰 strip의 크기에 맞게 잘라 위를 덮어준 후 실온에서 1시간동안 반응시킨다. (20~27℃)

9) 각 웰의 내용물을 흡입하여 제거하고 희석한 세척액으로 웰 당 200㎕씩 5회 세척한다.

10) 플레이트를 뒤집어 흡습지 위에 털어 남아 있는 세척액을 완전히 제거한 다음 자동 피펫으로 TMB 기질용액을 각 웰에 100㎕씩 분주한다.

11) 분주가 끝난 플레이트는 빛이 들어오지 않는 상태로 실온에서 30분 동안 반응시킨다. (20~27℃)

12) 자동 피펫으로 반응정지액을 각 웰에 100㎕씩 분주한다.

13) 각 웰의 흡광도를 450 nm에서 측정한다. 흡광도는 반응정지액을 넣은 후 30분 이내에 측정한다.

7.1. 시험을 시험방법에 따라 정확하게 수행했을 경우 대조시약들의 흡광도는 다음 범위에 있어야 한다.

1) 시약 공백(Reagent Blank)은 0.1 이하이어야 한다.

2) 양성표준시료(Positive Control): >0.30 (Reagent Blank 제외값)

3) 음성표준시료(Negative Control): <0.10 (Reagent Blank 제외값)

4) 보정액(Calibrator) : 0.07 - 0.13 (Reagent Blank 제외값)

만약 위와 같은 값이 나오지 않으면 실험이 잘못된 것으로 간주하여 재시험하여야 한다.

7.2. 판정기준(Cut-Off)값의 계산

판정기준(Cut-Off)값은 보정액(Calibrator)의 흡광도(A450)에 1.54를 곱한 값으로 정한다.

예)만약 보정액(Calibrator)의 흡광도가 0.174이고 Reagent Blank의 흡광도가 0.089이면 이면 판정기준값은 다음과 같이 계산된다.

보정액 흡광도 = 0.174 - 0.089 = 0.085

7.3. 판정결과의 해석

검사된 검체의 판정은 다음과 같이 한다.

검체의 흡광도(A450)

────────── = 검체의 보정값 (Signal to Cut-Off Ratio)

판정기준값(Cut-Off)

1) 검체의 보정값(S/CO)이 1 이하일 경우: 음성

2) 검체의 보정값(S/CO)이 1 - 1.3일 경우 : 판정보류 또는 양성 (특이도 90% 수준)

3) 검체의 보정값(S/CO)이 1.3을 초과할 경우: 양성 (특이도 95% 이상수준)

판정예) 시약공백(Reagent Blank)을 제외한 보정액의 흡광도가 0.085, 미지의 혈청 검체 3개의 흡광도가 각각 0.072, 0.154, 0.483으로 나왔을 경우 판정은 다음과 같다.

판정기준값은 0.085 x 1.54 = 0.131

음성으로 판정이 된 경우는 검사된 혈청 중에 존재하는 항PKA IgG의 양이 없거나 정상적인 범위 내에 있는 경우이고 판정유보인 경우는 혈청 중에 존재하는 항PKA IgG의 양이 정상적인 범위보다는 약간 높으나 판정을 하기에는 불확실한 경우이며 판정결과가 양성일 경우는 혈청 중 항PKA IgG의 양이 특이하게 높아 종양의 존재가 의심이 되는 경우이다.